對(duì)于廣大的生物科研人員來(lái)說(shuō),養(yǎng)細(xì)胞、養(yǎng)細(xì)菌、提核酸等都是實(shí)驗(yàn)室的常見(jiàn)操作,實(shí)驗(yàn)操作費(fèi)時(shí)費(fèi)力,過(guò)程中可能還會(huì)遇到各種坑。
核酸分為脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA),它是由許多核苷酸單體聚合成的生物大分子化合物,為生命的最基本物質(zhì)之一。核酸的提取分別為DNA 提取和RNA提取,二者的提取原理大致相同,簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)分為細(xì)胞或者組織的裂解和核酸純化兩大步驟。
核酸提取純化方法常用的有酚/氯(lü)仿抽提法、離心柱法、磁珠法等。
1、酚/氯(lü)仿抽提法
乙(xi)烯氯(lü)仿提取DNA是利用酚是蛋白質(zhì)的變性劑,反復(fù)抽提,使蛋白質(zhì)變性,SDS(十二烷基磺酸鈉)將細(xì)胞膜裂解,在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白質(zhì)或多肽或小肽分子,變性降解核蛋白,使DNA從核蛋白中游離出來(lái)。
酚/氯(lü)仿抽提法的優(yōu)點(diǎn)是成本較低,對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求也不高。該方法的缺點(diǎn)也很明顯:由于使用了苯(fen)酚、氯(lü)仿等有機(jī)試劑,毒性較大,長(zhǎng)時(shí)間操作對(duì)人員健康有較大影響;而且核酸的回收率較低,損失量較大。
離心柱純化
這里以DNA提取離心柱為例。離心柱結(jié)構(gòu)主要是特殊硅基質(zhì)吸附材料,能特異性吸附DNA,而RNA與蛋白質(zhì)則會(huì)穿過(guò)。該方法能選擇性地吸附核酸而不吸附蛋白質(zhì)及鹽,從而實(shí)現(xiàn)核酸與蛋白質(zhì)及鹽的分離,是目前試劑盒提取廣泛使用的方法。
該方法受人為操作因素影響小,提取DNA的純度穩(wěn)定性很高;而且離心柱法提取DNA的純度比傳統(tǒng)酚氯(lü)仿法提取的要高。離心柱法其低廉的價(jià)格和相對(duì)便捷的操作,漸逐取代了傳統(tǒng)DNA提取方法,被高校科研所等市場(chǎng)普遍接受。
該方法的缺點(diǎn)是需要較多的樣本,對(duì)于珍稀樣本則不適合采用此方法。當(dāng)樣品過(guò)量時(shí),需要反復(fù)進(jìn)行離心,對(duì)樣品的提取效率較低,不便于高通量、自動(dòng)化操作。與現(xiàn)代生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的高通量、自動(dòng)化要求格格不入,特別是在基因診斷、疾病檢測(cè)、轉(zhuǎn)基因檢測(cè)等領(lǐng)域,離心柱法DNA提取需要大量的操作人員及儀器設(shè)備。當(dāng)面對(duì)突發(fā)疫情時(shí),更是需要有高通量的DNA提取設(shè)備與方法才能更有效準(zhǔn)確的監(jiān)測(cè)疫情、控制疫情。
磁珠法
磁珠法是一種固相載體可逆化固定(SPRI)的分離純化方法,主要原理為:在不同濃度的PEG(polyethylene glycol;聚乙二醇)中,會(huì)有不同片段大小的DNA吸附在磁珠的羧基修飾層上,這些DNA可以再溶解在水中,以此來(lái)洗脫回收。
實(shí)驗(yàn)使用的磁珠分為五層,由內(nèi)而外依次為:聚苯乙(xi)烯材料的核心、超順磁材料(主要為四氧化三鐵)、第二層聚苯乙(xi)烯材料、第二層超順磁材料以及表面粗糙的羧基修飾層。粗糙的表面更利于核酸與羧基修飾層結(jié)合。該方法將純化介質(zhì)包被在納米級(jí)的磁珠表面,通過(guò)介質(zhì)對(duì)DNA的吸附,在外加磁場(chǎng)的作用下使DNA附著于磁珠并定向移動(dòng),從而達(dá)到核酸與其它物質(zhì)分離的目的。
與其它集中方法相比,磁珠法具有無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì),包括:
(1)提取靈敏度高 ,只需微量的樣本就可以完成對(duì)核酸的提取;
(2)純化的純度高 ,磁珠與核酸的特異性結(jié)合能使核酸充分與雜質(zhì)分離,使得提取的核酸純度高、濃度大;
(3)能夠?qū)崿F(xiàn)自動(dòng)化、大批量操作,通過(guò)機(jī)器自動(dòng)化完成操作,所需人力少,而且同時(shí)可以完成多個(gè)樣本的大批量操作。以32孔的核酸自動(dòng)提取儀為例,用一個(gè)樣品的提取時(shí)間即可實(shí)現(xiàn)對(duì)最多32個(gè)樣品的處理,符合生物學(xué)高通量的操作要求,使得傳染性疾病爆發(fā)時(shí)能夠進(jìn)行快速及時(shí)的應(yīng)對(duì)。
(4)操作簡(jiǎn)單、用時(shí)短,整個(gè)提取流程只有四步,根據(jù)儀器不同,部分儀器提取時(shí)間可以縮短到30分鐘,大大提高了實(shí)驗(yàn)效率;
(5)安全無(wú)毒,不使用傳統(tǒng)方法中的苯、氯(lü)仿等有毒試劑,對(duì)實(shí)驗(yàn)操作人員的傷害減少到最少,完全符合現(xiàn)代環(huán)保理念;
近年來(lái)磁珠法已成為核酸提取的必備工具之一,也是核酸自動(dòng)化提取設(shè)備的必備組件之一。對(duì)于實(shí)驗(yàn)樣本量大,經(jīng)常做實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)人員來(lái)說(shuō),自動(dòng)核酸提取儀是一個(gè)不錯(cuò)的選擇。而且對(duì)于各類核酸,不論是質(zhì)粒DNA、基因組DNA,還是RNA等,一臺(tái)自動(dòng)核酸提取儀都可以滿足實(shí)驗(yàn)人員的提取要求。
目前自動(dòng)核酸提取儀基本都能滿足大批量核酸提取的需求,對(duì)于不同的樣本(如全血、質(zhì)粒、培養(yǎng)細(xì)胞、組織等)和核酸類型(基因組DNA,病毒DNA/RNA,質(zhì)粒DNA等)等能適配,自動(dòng)核酸提取儀相對(duì)傳統(tǒng)的酚氯(lü)仿法及離心柱法要方便便捷許多。
山東博科-核酸提取儀
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